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    猪低氧诱导因子1α(HIF-1α)elisa试剂盒使用方法

    点击次数:40 发布时间:2022/1/21
    提 供 商: 上海研生生化试剂有限公司 资料大小:
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    猪低氧诱导因子1α(HIF-1α)elisa试剂盒说明书

    试验原理:

    TRH试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知TRH浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将TRH和生物标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中TRH的浓度呈比例关系。

    试剂盒内容及其配制

    试剂盒成份(2-8℃保存) 96孔配置 48孔配置 配制

    96/48人份酶标板 1块板(96T) 半块板(48T) 即用型

    塑料膜板盖 1块 半块 即用型

    标准品:24ng/ml 1瓶(0.6ml) 1瓶(0.3ml) 按说明书进行稀稀

    空白对照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml) 即用型

    标准品稀释缓冲液 1瓶(5ml) 1瓶(2.5ml) 即用型

    生物标记的抗TRH抗体 1瓶(6ml) 1瓶(3.0ml) 即用型

    亲和链酶素-HRP 1瓶(10ml) 1瓶(5.0ml) 即用型

    洗涤缓冲液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml) 按说明书进行稀释

    底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型

    底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型

    终止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型

    猪低氧诱导因子1α(HIF-1α)elisa试剂盒自备材料

    1. 蒸馏水。

    2. 加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

    3. 振荡器及磁力搅拌器等。

    安全性

    1. 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。

    2. 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

    3. 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

    操作注意事项

    1. 试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。

    2. 实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。

    3. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

    4. 使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。

    5. 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

    6. 洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

    7. 底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。

    8. 加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。

    9. 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

    样品收集、处理及保存方法

    1、 血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

    2、 血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

    3、 细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

    4、 保存------如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70 ℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

    试剂的准备

    1. 标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行:

    24 ng/ml (6号标准品) 原倍浓度不用稀释直接加入50ul。

    12 ng/ml (5号标准品) 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液

    6.0 ng/ml (4号标准品) 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液

    3.0 ng/ml (3号标准品) 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液

    1.5 ng/ml (2号标准品) 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液

    0.75 ng/ml (1号标准品) 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液

    0 ng/ml (空白对照) 原始浓度不用稀释直接加入50ul。

    2. 洗涤缓冲液(50×)的稀释:蒸馏水50倍稀释。

    猪低氧诱导因子1α(HIF-1α)elisa试剂盒操作步骤

    1. 使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。

    2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。

    3. 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时。

    4. 甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。

    5. 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。

    6. 甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。

    7. 每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照。

    8. 取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。

    9. 在450nm波长处测定各孔的OD值。

    建议使用的实验方案

     标准品浓度(ng/ml) 

    A 24 24 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

    B 12 12 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

    C 6.0 6.0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

    D 3.0 3.0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

    E 1.5 1.5 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

    F 0.75 0.75 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

    G 0 0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

    H 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品


    局限

    6号标准品以上的结果为非线性的,根据此标准曲线无法得到的结果。

    试剂盒性能

    1. 灵敏度:zui小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

    2. 特异性:不与其它细胞因子反应。

    3. 重复性:板内、板间变异系数均小于10%。

    猪低氧诱导因子1α(HIF-1α)elisa试剂盒结 果 判 断 与 分 析

    1、仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

    2、以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的TRH标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线,样品的TRH含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

    3、检测值范围:0-24ng/ml

    4、敏感度: 0.1 ng/ml


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